РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ КРЫМСКО-КОНГОЛЕЗСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ НА ОСНОВЕ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ

Аннотация Введение. Крымская–Конго геморрагическая лихорадка (ККГЛ) остается высоколетальной трансмиссивной зоонозной инфекцией, передающейся клещами, с расширяющейся эндемичностью в Казахстане, что обусловлено климатически обусловленными изменениями в распределении клещей рода Hyalomma и перемещением диких и домашних животных; поэтому быстрое лабораторное подтверждение имеет решающее значение, и в данном исследовании оценивается чувствительность и специфичность нового набора праймеров и зонда для ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-PCR) для выявления РНК вируса ККГЛ в биологических образцах. Цель. Разработка, оптимизация и оценка диагностической эффективности системы праймеров и зонда для детекции РНК вируса ККГЛ методом RT-PCR в режиме реального времени. Материалы и методы. На основе последовательностей вируса ККГЛ, представленных в базе данных GenBank, с использованием программы Gen Runner были спроектированы праймеры и зонд, фланкирующие высококонсервативный участок (138 п.н.) 5'-нетранслируемой области S-сегмента вируса. Предел обнаружения (LOD) оценивали с использованием десятикратных разведений плазмидной ДНК, содержащей целевой фрагмент, в диапазоне от 106 до 100 копий/реакцию. Эффективность амплификации составила 98,6 % (R2 = 0,998), коэффициент вариации между повторностями не превышал 3,5 %, что свидетельствует о высокой воспроизводимости метода. Специфичность теста проверяли на образцах РНК нецелевых вирусов (ОРВИ и вирус клещевого энцефалита) и на полевом материале (118 экземпляров клещей и клинические образцы от двух пациентов). Результаты сравнивали с коммерческой тест-системой «АмплиСенс® CCHFV-FL»; уровень согласия составил κ = 1,0 (полное совпадение). Результаты. Разработанная система показала высокий уровень чувствительности: предел обнаружения составил от 100 pg до 10 fg, что эквивалентно 102–104 копиям/реакцию. Перекрестных реакций с нецелевыми вирусами не выявлено. В ходе тестирования полевых образцов РНК вируса ККГЛ была обнаружена в двух пулах клещей Hyalomma scupense из Кызылординской области и в двух клинических образцах от пациентов из Жамбылской области. Заключение. Предложенная система праймеров и зонда отличается высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью, что подтверждает ее потенциал для создания отечественной диагностической тест-системы и мониторинга циркуляции вируса ККГЛ в природных очагах Казахстана.